Т.Г. Щербатюк

Государственная медицинская академия, Нижний Новгород

Озонотерапия злокачественных новообразований: за и против

Успех любого терапевтического метода с использованием физических факторов воздействия определяется знаниями природы нарушений, на коррекцию которых они направлены, с одной стороны, и механизмов их биологического действия, с другой.

Еще в 1892 г. И. И. Мечников определил опухолевый процесс как регресс, движение в сторону менее организованной биологической формы, в сторону примитивной, но более устойчивой организации. Поскольку в обмене бластомных клеток превалирует брожение, филогенетически более древний процесс, чем окисление, то опухоль представляет собой своеобразный возврат к более ранней эволюционной ступени существования, при этом более поздний и менее глубоко укоренившийся регуляторный механизм утрачивается [1—3]. В связи с этим логично предположить, что создание «эволюционного скачка» — искусственное оксидантное окружение опухоли — может внести дезорганизацию в примитивный анаэробный метаболизм неоплазмы.

Согласно кислородно-перекисной концепции онкогенеза, многие противоопухолевые мероприятия можно разделить на две группы. Лечебные воздействия первой группы направлены на снижение внутриклеточного рО2 и уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ), второй группы, напротив, — так или иначе связаны с еще большей интенсификацией ПОЛ в опухолевых клетках и летальным их повреждением токсическими продуктами ПОЛ [4]. В связи с этим озон, обладающий мощными окислительными свойствами, может быть использован как противоопухолевое средство второй группы.

N. Altman в своей книге «Oxygen healing therapies» [5], обобщая накопленный экспериментальный и клинический опыт мировой практики озонотерапии, сообщает о применении озона в течение последнего десятилетия и в онкологии. Иностранные исследователи в своих попытках использовать озон основываются на двух открытиях.

Первое открытие было заявлено O. Warburg в 1966 г., он утверждал, что ключевой посылкой для развития опухоли является недостаток кислорода на клеточном уровне. Второе открытие, о котором впервые сообщил J. Varro [6], показало непереносимость опухолевыми клетками пероксидов. В связи с этим было высказано предположение, что озон и перекись водорода могут повреждать метаболизм раковых клеток [6]. Однако работы J. Varro, так же, как результаты более ранних исследований отечественных ученых А.И. Журавлева, Б.Н. Тарусова , которые на большом экспериментальном материале показали, что содержание перекисей в опухолях понижено по сравнению с нормальными тканями [7—9], не нашли применения в клинической онкологии.

В 1980 г. F. Sweet с соавторами представил доказательство ингибирующего действия озона по отношению к опухолевым клеткам в условиях in vitro. Изучая влияние определенных концентраций озона на развитие культур опухолевых клеток, полученных из злокачественных новообразований легких, молочной железы и матки, они выявили в 90% случаев подавление роста неоплазм. При этом была отмечена слабая способность опухолевых клеток компенсировать окислительный взрыв, вызванный озоном, по сравнению с нормальными клетками [10]. M. Arnan, L. DeVries [11] изучали влияние озона на карциному, привитую мышам. Результаты эксперимента показали, что животные, получавшие инъекции озоно-кислородной смеси, прожили на 30—48 дней дольше, чем мыши контрольной группы. H. Karlic с коллегами [12] обнаружил селективное подавление озоном роста опухолевых клеток карциномы яичников, аденокарциномы яичников и карциномы эндометрия. Аналогичные результаты были получены в работах K. Zanker и R. Kroczek [13].

Сотрудники Черкасского инженерно-технического института и онкодиспансера г. Черкассы [14] нашли in vitro такие условия (подбор растворителей озона, время насыщения раствора окислителем), при которых происходили лизис, клеточный пикноз и множественное разрушение ядерной субстанции опухолевых клеток. Авторы отмечают, что наблюдаемые процессы сходны с облучением, так как в зоне опухолей в жидкой фазе под воздействием радиации также синтезируются кислородсодержащие окислители или АФК. Однако при озоно-радикальной хемодеструкции не наблюдается ожога, некроза нормальных клеток (по трассе облучения), а также, вероятно, отсутствует влияние воздействия высокочастотных колебаний. Авторы назвали этот процесс «мягким облучением».

Механизмы действия одного из основных методов терапии злокачественных новообразований — ионизирующего излучения (ИИ) — связаны с теми процессами, которые включают развитие свободно-радикальных реакций [15—17]. Логично, что озонированный физиологический раствор, представляющий собой смесь активных форм кислорода, в комбинированном использовании с ИИ, приведет к повышению избирательности действия последнего, основанной на кислородном эффекте.

Целью нашей работы явилось исследование озона и ИИ на организм животных с экспериментальными опухолями.

Материалы и методы. Эксперименты были выполнены на 500 белых нелинейных крысах-самцах массой 200 г. Формирование модели солидной опухоли проводилось путем подкожной трансплантации клеток лимфосаркомы Плисса, приобретенных в Онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). Озонотерапию подопытных животных осуществляли путем интра– и паратуморального, а также внутрибрюшинного введения озона в виде озонированного физиологического раствора (ОФР) в течение 5 сеансов.

ОФР получали следующим образом: через флакон емкостью 50 мл со стерильным физиологическим раствором в течение 5 мин пропускали озоно-кислородную смесь со скоростью газотока 1 л/мин. Озоно-кислородную смесь получали из медицинского сверхчистого кислорода на озонаторе (ННИПИ «Квазар»). ОФР применяли сразу после барботирования. Используемые концентрации озона контролировали в газовой фазе спектрофотометрическим методом на СФ-26 при длине волны 254 нм.

ОФР вводился в качестве монотерапии, а также в плане предлучевой подготовки (комбинированное воздействие). Воздействие ИИ проводили следующим образом: животные подвергались гамма-облучению на установке радиологического отделения Городского онкологического диспансера (врач-радиолог — А.Д. Синельщиков). Их декапитировали под эфирным наркозом, производили забор крови и опухолевой ткани. Проводились биохимические анализы цельной крови, плазмы, эритроцитов и опухоли. Свободно-радикальную активность субстратов косвенно оценивали методом индуцированной хемилюминесценции [18] на биохемилюминометре БХЛ-06, сопряженном с компьютером IBM PC/АТ в диалоговом режиме (разработка Нижегородского НИЦ «Биоавтоматика»). Молекулярные продукты липопероксидации: первичные — диеновые конъюгаты (ДК), вторичные — триеновые конъюгаты (ТК), — определяли УФ-спектрофотометрически. Антиоксидантную систему (АОС) оценивали по активности ферментативных компонентов: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы. Исследовали функциональную активность фагоцитирующих клеток. Анализ морфологических изменений лимфосаркомы проводили в гистологических препаратах опухоли, определяя индекс клеточности и удельный объем некротизированной ткани.

На первом этапе исследования для создания локального усиления окислительных реакций в опухолевой ткани мы посчитали целесообразным интра– и паратуморальное введение озона в виде ОФР. Результаты исследования показали, что введение ОФР, создающее повышенное свободно-радикальное окружение опухоли, инициирует процессы пероксидации в опухолевой ткани. Об этом свидетельствуют достоверное повышение интенсивности хемилюминесцентного свечения, а также увеличение содержания молекулярных продуктов ПОЛ: ДК, ТК, оснований Шиффа (ОШ) — в гомогенатах опухолевой ткани.

На фоне инициации ПОЛ в клетках саркомы наблюдается значительное снижение активности антиоксидантных ферментов СОД и каталазы. Вероятно, разрушение АОС защиты злокачественного новообразования, вызванное локальным введением ОФР, способствует тому, что опухоль не в состоянии сдерживать усиленное свободно-радикальное окисление, которое, в конечном итоге, разрушает клетки опухоли.

Результаты и обсуждение. Результаты исследования ультраструктуры клеток лимфосаркомы Плисса показали, что воздействие (ОФР) при концентрации озона в газовой cмеси 3000 мкг/л вызывает резко выраженные нарушения лимфосаркомы. Опухолевый узел — с выраженным инвазивным ростом. Отмечаются признаки полнокровия, отека, дистрофических изменений. В строме наблюдаются множественные участки кровоизлияний. Нарушаются проницаемость сосудов, целостность сосудистых стенок. Характерно возрастание количества некротических явлений в цитоплазме клеток вплоть до разрушения плазмолеммы и выхода органелл в окружающее пространство.

Выраженные необратимые повреждения метаболизма опухолевых клеток приводят, вероятно, к ослаблению системного действия злокачественного новообразования на организм. Это проявляется, прежде всего, в восстановлении прооксидантно-антиоксидантного баланса организма-опухоленосителя. Воздействие ОФР на опухоль в организме животных подавляет хемилюминесцентную активность плазмы крови, снижает содержание ДК, ТК, ОШ. Ингибирование ПОЛ связано с усилением антиоксидантной способности организма. Результаты исследования выявили повышение активности ферментативных компонентов АОС защиты организма: СОД, каталазы, глутатинпероксидазы и глутатинредуктазы.

Таким образом, воздействие ОФР на опухоль останавливает дезорганизацию метаболизма, вызванную наличием злокачественного образования.

Т. А. Гончаровой на этой же модели показано, что на фоне введения ОФР в опухолевой ткани увеличивается уровень цАМФ и уменьшается цГМФ, а это свидетельствует о снижении скорости пролиферативных процессов; выявлено также, что воздействие ОФР способствует восстановлению энергетического метаболизма печени [19].

Критерием эффективности любого антиканцерогенного воздействия считается увеличение продолжительности жизни экспериментальных животных. Этот показатель для крыс с лимфосаркомой Плисса составил 30%.

Положительные результаты первого этапа исследования выявили противоопухолевый эффект интра– и паратуморального введения озона. Задачей следующего этапа явилось изучение биологических эффектов озона при парентеральном введении ОФР животным-опухоленосителям и его свойства при последующем ИИ. Был произведен подбор наиболее эффективной концентрации ОФР для парентерального введения. Критерием эффективности служило уменьшение диаметра опухоли при минимальном повреждающем действии озона на целостный организм. Этому условию отвечала концентрация 400 мкг/л, она и использовалась в дальнейшем для изучения комбинированного воздействия озона и ИИ.

Анализ полученных результатов позволяет предположить, что озон модифицирует действие ИИ за счет кислородного эффекта. Он повышает радиочувствительность опухоли путем ее искусственной оксигенации (преодоления радиорезистентности гипоксических клеток опухоли). Превентивное использование озона позволяет снизить используемую дозу облучения, и, следовательно, уменьшить нагрузку на здоровые ткани, мобилизовать антиоксидантные ресурсы, восстановить защитные свойства организма.

Для подтверждения эффективности применяемых воздействий целесообразно рассмотреть изменение такого показателя, как масса опухолевой ткани, в разных экспериментальных группах. Оценка результатов проводилась на следующий день после окончания воздействия. Выявлено достоверно меньшее значение массы опухоли в группах «озон+ИИ» — на 39%, «ИИ» — на 24% по сравнению с данным показателем в группе «без воздействия», что является очевидным подтверждением эффективности физико-химических воздействий, использованных в нашем эксперименте.

Таким образом, озон в высоких концентрациях при локальном воздействии (3000 мкг/л) обладает антиканцерогенным эффектом, а в комплексном использовании с ИИ (400 мкг/л) повышает эффективность противоопухолевой терапии.

Серьезного внимания заслуживает тот факт, что при изучении дозозависимых эффектов озона выявлена концентрация ОФР (900 мкг/л), которая при парентеральном введении способствует рассасыванию первичного опухолевого узла, однако у 17% животных вызывает метастазирование лимфосаркомы. ОФР в этом случае, хотя и приводит к деструкции опухоли, но вызывает мощную свободно-радикальную атаку, превышающую антиоксидантные возможности организма животного и создает, таким образом, канцерофильные условия для нормальных тканей, что приводит к метастазированию опухоли. Это нашло подтверждение как в экспериментальных работах иностранных ученых, так и в теоретических — отечественных.

Этот факт можно объяснить тем, что устойчивое прооксидантное состояние и избыточный уровень ПОЛ создают в клетке «канцерогенную» ситуацию, вызывают бластомную трансформацию. Изменение нормального течения свободно-радикального окисления может явиться первичным физико—химическим процессом, промотирующим трансформацию. Мишенями свободных радикалов являются нуклеиновые кислоты, белки и липиды, так как они легко взаимодействуют с полиненасыщенными жирнокислотными остатками, сульфгидрильными группами и аминогруппами полипептидов, двойными связями различных биологических молекул. Проявление этих реакций — изменения в генетическом аппарате клеток, структуре и функциях клеточных мембран, нарушения регуляторных процессов организма [20—21]. Доказано, что синглетный кислород способствует трансформации мышиных эмбриональных фибробластов, индуцируемой лучевыми или химическими факторами. Перекись водорода, перекись бензоила и некоторые другие органические перекиси промотируют трансформацию мышиных эпидермальных клеток, инициированую химическими канцерогенами [21].

Следует отметить, что радикалы О2 являются слабыми инициаторами процесса трансформации нормальных клеток в опухолевые, но достаточно сильными промоторами этого процесса. Активность АФК значительно увеличивается в локусах, содержащих ионы железа, с участием которых развивается реакция Фентона, в результате чего образуются гидроксильные радикалы с высокой реакционной способностью. Они реагируют практически со всеми макромолекулами клетки, включая ДНК, белки, липиды и углеводы (константа скорости окисления липидов для HO+ в 106 раз выше, чем для О2– и Н2О2) [21, 22].

Генотоксичными являются и некоторые продукты ПОЛ, они могут образовывать аддукты с нуклеотидами, повреждая ДНК и индуцируя обмен сестринскими хроматидами. Ацетальдегид и малоновый диальдегид вызывают хромосомные аберрации, а формальдегид является канцерогеном для крыс. 4-оксиалкеналь способен вследствие стабильности и высокой гидрофобности проникать в ядро через детоксицирующие системы цитоплазмы, повреждая геном [21].

Следует отметить, что использование озона в онкологии ограничивается тем, что в большинстве случаев он применяется эмпирически, без рациональной основы и соответствующих средств контроля. Известно, что повышенная его концентрация в воздухе способствует появлению легочной токсичности [23]. Этой проблеме были посвящены несколько работ, в одной из которых авторы показали незначительное, статистически недостоверное увеличение легочных опухолей у мышей штамма А/J, откуда был сделан вывод, что озон не является канцерогеном для данного штамма [23]. В то же время существуют исследования, указывающие на неэффективность внутривенного введения озона в случае карциномы Эрлиха и саркомы-180 и обнаруживающие увеличение легочных метастаз у мышей с фибросаркомой NR-FS [24]. Наличие столь противоречивых данных можно объяснить тем, что озонотерапия является дозозависимой и требует тщательного подбора условий, при которых она оправдана.

Заключение. Анализ механизмов известных противоопухолевых физико-химических воздействий показывает что, все они направлены на изменение кислородного, свободно-радикального гомеостаза. На наш взгляд, озонотерапия (в частности, использование ОФР) — наиболее физиологичный, эффективный и доступный метод, позволяющий воздействовать на свободно-радикальные процессы. Именно поэтому мы считаем, что озон должен занять свою достойную нишу в комплексном лечении злокачественных новообразований.

Литература

1. Шапот В.С. Прогрессия опухоли и организм. Вопросы онкологии 1980; 3: 103—108.
2. Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов М: Наука; 1977; 419 с.
3. Несынов Е.П. Живое глазами химика. Киев: Наукова думка; 1981; 205 с.
4. Лю Б.И., Шайхутдинов Е.М. Физико-химические и биокибернетические аспекты онкогенеза. Алма-Ата; Гылым; 1991; 270 с.
5. Altman N. Oxygen healing therapies: for optimum health and vitality. Vermont: Healing Arts Press Rochester; 1994; 200 р.
6. Varro J. Die krebsbehandlung mit ozon. Erfahrung-sheilkunde; 1974; 23: 178—181.
7. Журавлев А.И. Свободно-радикальная биология. М: Московская ветеринарная академия; 1993; 70 с.
8. Бурлакова Е.Б., Архипова Г.В., Голощапов А.Н. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М: Наука; 1982.
9. Бурлакова Е.Б. О некоторых физико-химических критериях химиотерапии злокачественных новообразований. В кн.: Физико-химические механизмы злокачественного роста. М: Наука; 1970; с. 41—49.
10. Sweet F. Ozone selectivity inhibits growth of cancer cells. Science 1980; 209: 931—933.
11. Arnan M., DeVries L. Effect of ozone/oxygen gas mixture directly injected into the mammary carcinoma of the female C3H/HEJ mice. In: Medical applications of ozone. 1983.
12. Karlic H., Kucera H., Metka M. Ozone and ionisirender Strahlung in vitro-modeleine pilostudie an vier gynekologischen tumorenl. Strahlenther and Oncol; 1987; 163: 37—42.
13. Zanker K., Kroczek R. The mystery of molecule-ozone: antiproliferative, immunmodulative, synergistic to chemotherapy and carcinogenetic. In: IX Congress of Ozone; 1989; p. 55—68.
14. Столяренко Г.С. Теоретические основы озоно-радикального избирательного метода хемодеструкции клеток раковых опухолей. В кн.: Сборник научн. работ 1-й Междунар. науч.-практ. конф. «Местное и парентеральное использование озонотерапии в медицине». Харьков; 2001; с. 99—101.
15. Абросимов А.Ю. Спонтанная и индуцированная облучением гибель опухолевых клеток. Вопросы онкологии 1992; 38(4): 515—526.
16. Мосиенко В.С., Загоруйко Л.И., Тодор И.Н. Особенности кислородного обмена при опухолевом росте. Экспериментальная онкология 1985; 7(5): 8—14.
17. Ярмоненко С.П., Конопляников А.Г., Вайнсон А.А. Клиническая радиобиология. М: Медицина; 1992; 323 с.
18. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной хемилюминесценции для оценки свободно-радикальных реакций в биологических субстратах. В кн.: Межвузовский сборник биохимии и биофизики микроорганизмов. Горький; 1983; с. 179—183.
19. Гончарова Т.А. Влияние озонированного физиологического раствора на функциональное состояние печени крыс в норме и с саркомой-45. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Нижний Новгород; 1997.
20. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соровский образовательный журнал 2000; 6(12): 13—19.
21. Сидорик Е.П., Баглей Е.А., Данко М.И. Биохемилюминесценция клеток при опухолевом процессе. Киев: Наукова думка; 1989; 216 с.
22. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах. Итоги науки и техники. Сер. Биофизика Т. 29. М: ВИНИТИ; 1991; 184 с.
23. Bocci V. Ozone as a bioregulator. Pharmacology and toxicology of ozonetherapy today. J Biolog Regulators and Homeostatic agents 1997; 10 (2/3): 31—53.
24. Kobayashi T.J., Isuge H., Orita K. Effects of insulin and glucagon on energy and carbohydrate metabolism of rat hepatouytes in primary cultur. Acta med, Okajama; 1988; 42(5): 259—269.