Нижегородский медицинский сайт

Разделы:


Главная

Врачам

Пациентам

Студентам

Мед. учреждения

Мед. анекдоты

Полезные ссылки

Обратная связь












 

© Л.М. Белова, Ю.П. Потехина, 2003 г.
УДК 577.23
Поступила 2.07.2003 г.

Л.М. Белова, Ю.П. Потехина

Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия;
Государственная медицинская академия, Нижний Новгород

Исследование конформационных изменений молекулы альбумина в различных условиях методом клиновидной дегидратации(сообщение I)


  Альбумин является одним из основных белков плазмы крови человека. Одна из важнейших функций альбуминов — транспортная. Эти белки участвуют в переносе свободных жирных кислот, холестерина, многих биологически активных веществ. Они способны связываться с желчными пигментами, в частности с билирубином. Значительная часть кальция в сыворотке также связана с альбуминами. По-видимому, они способны связывать любые гидрофобные и амфифильные лиганды малой молекулярной массы (до 1000 Д) [1, 2]. Недавно выявлен новый вид патологических изменений в молекулах белков: их первичная структура нормальна, однако нарушена их вторичная и/или третичная структура (конформация) [3]. Таким образом, патологические процессы могут сопровождаться изменением состояния молекул альбумина плазмы крови. Иногда это является результатом загрузки альбумина токсическими продуктами, которые печень и другие органы детоксикации не успевают выводить (например, при гипербилирубинемии). Однако в большинстве случаев дело обстоит иначе: чрезмерной перегрузки альбумина метаболитами нет, но изменена конформация молекулы альбумина [3]. Белок с измененной конформацией не может эффективно выполнять свою транспортную функцию. Следовательно, весьма важно при лечении больных контролировать изменение конформации молекулы сывороточного человеческого альбумина.

  В 1996 г. С.Н. Шатохиной и В.Н. Шабалиным (НИИ геронтологии МЗ РФ) [4] был предложен метод клиновидной дегидратации. Он позволяет делать видимой молекулярную организацию биологических жидкостей путем перевода ее на макроуровень. Это осуществляется при высушивании капли биожидкости на твердой подложке. Образование сухой пленки — фации — подчиняется строгим закономерностям: количество солей увеличивается от периферии к центру, а количество органических веществ — от центра к периферии. Это происходит по следующим причинам:

  испарение жидкости идет равномерно по всей поверхности капли;

  в силу того, что капля имеет разную толщину слоя в центре и на периферии, количество воды уменьшается неравномерно — на периферии быстрее, чем в центре;

  гидрофильность солей больше, чем гидрофильность органических соединений, поэтому соли начинают перемещаться в центр капли, вытесняя органические вещества на периферию (рис. 1).

Распределение неорганических солей и органических веществ в процессе высыхания капли биологической жидкости на твердой подложке [4]: а — сагиттальный разрез; б — вид сверху
Рис. 1. Распределение неорганических солей и органических веществ в процессе высыхания капли биологической жидкости на твердой подложке [4]: а — сагиттальный разрез; б — вид сверху

  В результате продолжающегося испарения связанной воды в белковой основе фации могут возникать трещины [5]. Развиваются достаточно мощные процессы растяжения и сжатия в результате свертывания молекул белка. Разрыв полимерной пленки происходит в наиболее слабых и перенапряженных областях [6].

  Цель исследования — показать принципиальную возможность оценки состояния молекулы альбумина методом клиновидной дегидратации.

  Материалы и методы. 10% раствор сывороточного человеческого альбумина готовили, растворяя лиофилизированный кристаллический альбумин в бидистиллированной воде. Денатурацию белка вызывали прибавлением к его раствору различных количеств (в объемных соотношениях 10:1; 5:1; 2:1; 1:1) 8 М раствора мочевины. Изменение активной реакции среды осуществляли добавлением в объемном соотношении 1:1 буферов с различными рН (1,68; 3,56; 4,04; 4,6; 5,0; 6,8; 7,2; 7,5; 7,8; 8,0; 9,18; 12,45). Контролем служил 10% раствор альбумина с добавлением бидистиллированной воды в объемном соотношении 1:1. Кроме того, были изучены растворы альбумина, предназначенные для трансфузии, с различными сроками годности.

  Проводилось исследование растворов альбумина методом клиновидной дегидратации [4]. На предметное стекло, специальным образом обработанное, наносили 0,01 мл исследуемой жидкости. Делали 4 повтора для проверки идентичности картин высохшей капли (фации). Высушивание проводили в течение 24—48 ч при комнатной температуре вдали от нагревательных приборов и прямых солнечных лучей. Фации исследовали с помощью оптического микроскопа в проходящем свете. Параллельно измеряли вязкость с помощью ультразвукового микровискозиметра (разработка Института прикладной физики РАН). Для обозначения вязкости использовали единицы измерения сантипуазы (спз), 1 спз равен 10–3 Па·с в системе СИ.

  Результаты. Картина высохшей капли 10% свежеприготовленного раствора альбумина (рис. 2, а) характеризуется наличием значительного количества радиальных трещин, которые по краю фации образуют арки.

а — с неистекшим сроком годности б — срок годности истек 03.1990 г.
Рис. 2. Картина фации 10% раствора сывороточного человеческого альбумина (увеличение 315): а — с неистекшим сроком годности; б — срок годности истек 03.1990 г.

  При старении альбумина увеличивается вязкость, уменьшается размер краевой зоны фации, появляются трещины нетипичной формы (прямые, круговые), патологические особенности (линии Валнера, параллельные и штриховые трещины), кристаллы в центральной зоне, нарушается радиальность и равномерность расположения трещин. Так, у фации 10% раствора альбумина, срок годности которого истек в 1990 г. (рис. 2, б) появляются концентрические массивы игольчатых кристаллов в центральной зоне; резко уменьшается число трещин, нарушается равномерность их расположения и исчезают аркообразные формы по краю фации.

  Прибавление 8 М раствора мочевины вызывает резкое снижение общего количества трещин в фации раствора альбумина и уменьшение размера краевой зоны (рис. 3). По мере увеличения концентрации мочевины в пробе вязкость жидкости возрастает (рис. 4). Подобные изменения были присущи всем изученным растворам альбумина.

а — в объемном соотношении 10:1 б — в объемном соотношении 1:1
Рис. 3. Картина фации 10 % раствора сывороточного человеческого альбумина с неистекшим сроком годности при добавлении 8 М раствора мочевины (увеличение 315):а — в объемном соотношении 10:1; б — в объемном соотношении 1:1.
Изменение количества трещин фации и вязкости 10% раствора сывороточного человеческого альбумина при добавлении денатурирующего агента — 8 М раствора мочевины — в различных объемных соотношениях Изменение количества трещин фации и вязкости 10% раствора сывороточного человеческого альбумина при добавлении денатурирующего агента — 8 М раствора мочевины — в различных объемных соотношениях
Рис. 4. Изменение количества трещин фации и вязкости 10% раствора сывороточного человеческого альбумина при добавлении денатурирующего агента — 8 М раствора мочевины — в различных объемных соотношениях

  При добавлении к раствору альбумина буферов с различной кислотностью наблюдалось значительное изменение числа и длины трещин (рис. 5). Характерно резкое снижение общего количества трещин фации и рост вязкости при крайних значениях рН (1,68; 9,18; 12,45), а также при рH, близкой к изоэлектрической точке данного белка, равной 4,7.

Изменение количества трещин фации и вязкости 10% раствора сывороточного человеческого альбумина при добавлении буферных растворов с различными значениями рН в соотношении 1:1 Изменение количества трещин фации и вязкости 10% раствора сывороточного человеческого альбумина при добавлении буферных растворов с различными значениями рН в соотношении 1:1
Рис. 5. Изменение количества трещин фации и вязкости 10% раствора сывороточного человеческого альбумина при добавлении буферных растворов с различными значениями рН в соотношении 1:1

  Обсуждение. Высохшие капли растворов, не содержащих белки, не имеют трещин. Не выявлено трещин и в высохшей капле растворов аминокислот [7]. Высохшие пленки растворов различных белков имеют специфичные морфологические параметры, в частности количество и характер трещин [7, 8]. Данное свойство обусловлено специфичной структурой макромолекулы белка [8].

  Мочевина вызывает глубокую денатурацию (с потерей четвертичной, третичной и, возможно, вторичной структуры) молекулы белка за счет расщепления дисульфидных связей [2]. Прибавление ее к раствору альбумина приводит к уменьшению ширины краевой зоны и общего количества трещин, вплоть до полного их исчезновения, и росту вязкости. Таким образом, глубокое нарушение структуры белка сопровождается изменениями этих параметров фации.

  Менее значительные изменения в структуре белковой молекулы были вызваны изменением кислотности раствора. С приближением рН раствора белка к изоэлектрической точке его набухаемость, растворимость, вязкость и многие другие характеристики принимают экстремальные значения. Изоэлектрическая точка альбумина равна 4,7. Поэтому резкое снижение количества и длины трещин в высохшей капле раствора белка, рост его вязкости при рН=4,6, весьма показательны. Видимо, подобные экстремальные значения данных показателей именно при рН, практически равном изоэлектрической точке, связаны с резким изменением конформации белковой молекулы в этой точке. Известны 5 конформаций альбумина, которые могут переходить друг в друга при изменении рН [9]. Изменение рН белкового раствора приводит к изменению пространственной конфигурации белковой молекулы, что в наших опытах сопровождалось изменением количества трещин и вязкости.

  Старение препарата также сопровождается изменением количества и характера трещин в картине высохшей капли. Аналогичные изменения наблюдаются при старении синтетических полимеров [10]. Вероятно, процесс старения белкового раствора сопровождается изменением конформационной структуры его молекул.

  Из различных гидродинамических свойств растворов макромолекул ни одно не связано с их формой столь же тесно, как вязкость. Молекулы высокомолекулярных соединений в развернутом состоянии придают растворам более высокую вязкость, чем свернутые в спираль или клубок. Изменения вязкости растворов в наших экспериментах еще раз подтверждают изменения конформационной структуры белковых молекул.

  Таким образом, изменение конформации макромолекулы белка при испарении связанной воды будет приводить к изменению типа и количества трещин. Следовательно, можно предположить, что имеет место взаимосвязь конформации молекул белка и характера трещин фации.

  Заключение. Проведенное исследование позволяет сделать следующие выводы:

  1. Конформационые изменения структуры макромолекулы альбумина отражаются на вязкости, характере и количестве трещин фации его раствора.

  2. Метод клиновидной дегидратации обладает высокой чувствительностью к изменению конформации белковых молекул, что позволяет использовать его для исследования данного показателя в плазме крови больных в целях диагностики и контроля за лечением.

Литература

  1.   Добрецов Г.Е., Миллер Ю.И. Биохимия и физико-химия сывороточного альбумина. Центры связывания органических молекул. В кн.: Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Книга 1. Под ред. Ю.А. Грызунова и Г.Е. Добрецова. М: ИРИУС; 1994; с.13—28.

  2.   Степанов В.М. Молекулярная биология. Структуры и функции белков. М: Высшая школа; 1996; 335 с.

  3.   Лопухин Ю.М., Добрецов Г.Е., Грызунов Ю.А. Конформационные изменения молекулы альбумина: новый тип реакции на патологический процесс. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2000; 7: 4—9.

  4.   Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. Ранняя диагностика уролитиаза, определение степени его активности и состава камнеобразующих солей мочи (система Литос). Урология и нефрология 1998; 1: 19—23.

  5.   Бартенев Г.М., Френкель С.Я. Физика полимеров. Л: Химия; 1990; 450 с.

  6.   Гуль В.Е. Структура и прочность полимеров. М: Химия; 1987; 328 с.

  7.   Rapis E.G., Gasanova G. Yu. Autowave process in the dynamics of phase transition in a protein film. Sov Phys Tech Phys 1991; 36(4): 406—412.

  8.   Rapis E. Symmetry and self-organization in protein. Symmetry. Culture and Science 1995; 6(3): 439—441.

  9.   Комарова М.Н., Грызунов Ю.А. Строение молекулы альбумина и ее связывающих центров (обзор литературы). В кн.: Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Книга 2. Под ред. Ю.А. Гры­зунова и Г.Е. Добрецова. М: ГЭОТАР Медицина; 1998; с.28—51.

  10.   Бузоверя М.Э., Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. Кристаллографические методы в изучении феномена старения природных и синтетических полимеров. В кн.: Материалы науч.-практ. конференции «Проблемы геронтологии». Пушкино; 1998; c.133—140.








резка швеллера
Вверх | Назад

Главная | Врачам | Пациентам | Студентам | Мед.учреждения | Мед.анекдоты | Полезные ссылки



Нижегородский медицинский сайт
по вопросам размещения рекламы пишите здесь