М.Р. Гайнуллин, А.С. Шорина

Государственная медицинская академия; ЦНИЛ, Нижний Новгород

Биоинформатический анализ особенностей пространственного строения белков-мишеней убиквитилирования

Биоинформатика — новая междисциплинарная область исследований, развивающаяся на стыке биологии и современных компьютерных технологий. Толчком к ее возникновению послужило, в первую очередь, быстрое накопление экс­периментальных данных о структуре биомакромолекул — белков и нуклеиновых кислот. С момента опубликования первых работ о расшифровке аминокислотных и нуклеотидных последовательностей объем такого рода информации растет в экспоненциальной зависимости. В частности, количество материалов о структуре ДНК, депонированных в базе данных европейской молекулярно-биологической лаборатории EMBL Nucleotide Sequence Database, удваивается каждые 12 мес [1, 2]. Другой важнейшей предпосылкой развития биоинформатики стала возможность быстрого и общедоступного обмена информацией с помощью сети Интернет. Потенциал WWW (World Wide Web) позволяет претворить в жизнь новую парадигму современных компьютерных технологий — интеграцию пространственно удаленных систем хранения и обработки информации [3].

Развитие биоинформатических исследований осуществляется, в первую очередь, за счет свободного доступа к специализированным молекулярно-биологическим базам данных. Большинство их содержит исключительно структурные данные, однако в последнее время предпринимаются попытки интегрировать в соответствующих записях также необходимую дополнительную информацию. К примеру, в аннотированной базе данных SWISS-PROT собраны не только сведения о первичных структурах (более чем 120 тыс. белков), но также данные об их функции, особенностях доменной организации, возможных посттрансляционных модификациях и соответствующие литературные ссылки [4, 5]. Особый интерес представляет собой база PDB (Protein Data Bank), в которой депонирована информация о пространственной структуре белков, полученная методами рентгеноструктурного анализа и ядерно-магнитного резонанса [6, 7].

Следует подчеркнуть, что данные, депонированные в соответствующих базах, получены экспериментальным путем, и, следовательно, являются фактическим материалом. Электронная форма представления этих данных позволяет любому исследователю проводить необходимый ему анализ в соответствии с поставленными целями и задачами. Методический арсенал биоинформатики исключительно широк и практически ежедневно пополняется новыми концепциями и алгоритмами. Это позволяет решать большое число конкретных научных задач, используя имеющийся в наличии пакет специализированного программного обеспечения, либо опираясь на возможность интерактивного обращения к соответствующим ресурсам глобальной сети Интернет.

Находясь в процессе непрерывного динамического развития, биоинформатика — как самостоятельная область биохимии и молекулярной биологии — открывает перед исследователями практически неограниченные перспективы для решения фундаментальных и прикладных проблем современной биохимии [8—10]. В нашей работе мы использовали биоинформатические инструменты для исследования системы убиквитина.

Изменение физико-химических свойств и биологической активности белков путем их пост­трансляционной модификации является широко распространенной стратегией регуляции метаболических процессов в живой клетке. Один из таких механизмов реализуется за счет связывания (конъюгации) белка-мишени и убиквитина — термостабильного высококонсервативного белка с молекулярной массой 8,5 кДа. Процесс конъюгации заключается в образовании ковалентной изопептидной связи между C-концевым глицином (Gly76) молекулы убиквитина и e-аминогруппой остатка внутреннего лизина полипептидной цепи белка-мишени [11].

Убиквитилирование белков является энзиматическим АТФ-зависимым процессом. Многоступенчатую реакцию катализируют три различных фермента, обозначаемых обычно как компоненты Е1, Е2 и Е3 мультиферментного убиквитин-протеин лигазного комплекса. На первом этапе компонент Е1 (убиквитин-активирующий фермент) с использованием энергии АТФ связывает молекулу убиквитина. После этого происходит перенос убиквитина на компонент Е2, называемый «убиквитинконъюгирующий фермент». Компонент Е3, или собственно убиквитин-протеин лигаза, выполняет функции связывания белка-мишени и переноса молекулы убиквитина на соответствующий целевой внутренний остаток лизина, и, таким образом, завершает весь каталитический акт убиквитилирования. Так как в процессе катализа неизбежно физическое взаимодействие как между компонентами Е2 и Е3, так и между компонентом Е3 и белком-мишенью, компонент Е3 иногда именуется «docking protein»[12]. Схематично последний этап убиквитилирования — ковалентное присоединение молекулы убиквитина к белку-мишени, происходящее при участии компонентов Е2 и Е3 убиквитин-протеин лигазного комплекса, – представлен на рис. 1, а.

Рис. 1. Схема взаимодействия компонентов Е2 и Е3 убиквитин-протеин лигазного комплекса с убиквитином и белком-мишенью убиквитилирования при образовании: а — убиквитин-белкового конъюгата 1-го порядка (моноубиквитилированный белок-мишень); б — убиквитин-белкового конъюгата 2-го порядка (диубиквитилированный белок-мишень). S — субстрат убиквитилирования (белок-мишень); Ubi 1 и Ubi 2 – молекулы убиквитина, последовательно вступающие в реакцию; LysX, Lys48, Gly76 – аминокислотные остатки белка-мишени и убиквитина, участвующие в образовании изопептидной связи; волнистой чертой обозначена тиоэфирная связь между С-концевым глицином (Gly76) молекулы убиквитина и остатком цистеина активного центра убиквитин-протеин лигазы

Установлена способность убиквитина к полимеризации с образованием «разветвленной» мультиубиквитиновой цепи. Механизм формирования мультимера аналогичен конъюгации с белком-мишенью с тем лишь отличием, что в качестве акцепторной аминокислоты при образовании изопептидной связи выступает остаток лизина 48 (Lys48) другой молекулы убиквитина [13, 14]. Схема удлинения мультиубиквитиновой цепи отображена на рис. 1, б.

Метаболическая роль убиквитилирования внутриклеточных белков является в настоящее время предметом интенсивных исследований. Показано, что субстратами убиквитилирования являются многие белки, значимые в метаболическом отношении [11, 12, 15, 16]. Учитывая критическую роль данной посттрансляционной модификации в регуляции многих важнейших клеточных функций, представляется неоспоримым существование механизма тонкого ферментативного контроля над специфичностью отбора белков-мишеней. Однако, несмотря на значительное количество идентифицированных белков-субстратов убиквитилирования (на сегодняшний день более ста), вопрос о специфичности убиквитин-протеин лигазы остается нерешенным [17]. Значительную сложность данной проблеме придает исключительная гетерогенность пула субстратов убиквитилирования, включающего, в частности, такие разнородные по своим физико-химическим свойствам, структуре и внутриклеточной локализации белки, как гистоны, рецепторы гормонов и факторов роста, ферменты и т.д.

Так как нам представлялась целесообразной разработка методов биоинформатического анализа структурных особенностей белков-субстратов убиквитилирования, то целью данной работы стал поиск подходов к решению вопроса о субстратной специфичности убиквитин-протеин лигазы путем выявления сходства в пространственной структуре молекулы убиквитина и идентифицированных субстратов убиквитилирования. Поставленная задача решалась биоинформатическими методами с использованием информации о третичной и четвертичной структуре белков, депонированной в базе данных RCSB Protein Data Bank, пакета специализированных прикладных программ для визуализации и анализа пространственной организации биомакромолекул и оригинальной компьютерной программы, служащей для расчета расстояний между определенными аминокислотами в трехмерных структурах исследуемых белков.

Методы исследования.

Выбор объектов для биоинформатического анализа. Отбор белков-мишеней проводился с учетом следующих критериев: 1) наличие прямых экспериментальных данных об убиквитилировании данного белка (включение радиоактивно меченного убиквитина в состав конъюгата в опытах in vitro, результаты иммунохимического анализа или определение аминокислотной последовательности in vivo); 2) доступность трехмерной структуры целого белка (наличие кристаллографических данных, депонированных в базе данных PDB). Дополнительным критерием отбора служило наличие информации о специфическом убиквитилировании определенного остатка лизина.

Исходные данные. Для анализа использовалась информация о третичной структуре белков, депонированная в базе данных PDB под кодами доступа 1UBQ [18], 1EQZ [19] и 1F6S [20] для убиквитина, гистона H2A и a-лактальбумина соответственно.

Программное обеспечение. Визуализация трехмерной структуры белка, выявление аминокислот, формирующих поверхность молекулы, и расчет расстояния между ними выполнялись с помощью программ RasWin Molecular Gra­­phics 2.7.1 [21] и Accelrys ViewerPro 4.2. Оценка расположения отдельных аминокислотных остатков на поверхности белковой глобулы проводилась по степени их экспонированности в окружающую среду. Для этого использовалась программа MOLMOL, позволяющая проводить расчет доступности для растворителя аминокислотных остатков и отдельных функциональных групп [22]. Во всех случаях оценка экспонированности проводилась при стандартном радиусе молекулы растворителя, равном 1,4Е. Для исследования пространственного взаиморасположения определенных аминокислот применялась оригинальная программа Distance Searcher, написанная на языке C++ (разработчик — С.В. Припоров). Внешний вид интерфейса программы представлен на рис. 2.

Рис. 2. Внешний вид интерфейса программы Distance Searcher

Данная программа позволяет выявлять аминокислоты, находящиеся на заданном расстоянии друг от друга. Алгоритм поиска основан на анализе координат атомов, содержащихся в файле PDB. Пользователь определяет искомые аминокислоты (максимально четыре), задает дистанцию в Е между определенными атомами, входящими в их состав, и величину допустимого отклонения от этого расстояния. Результаты анализа сохраняются в текстовом файле формата PDB и содержат информацию о наборе аминокислот, удовлетворяющих заданным требованиям, выявленные дистанции между парами аминокислот и фрагменты из исходного файла данных, характеризующие каждую найденную амино­­­кислоту (рис. 3).

Рис. 3. Результат поиска потенциальных точек убиквитилирования в трехмерной структуре a-лактальбумина, выполненного с помощью программы Distance Searcher (фрагмент файла отчета)

Результаты. Теоретической основой работы служило предположение, что убиквитин-протеин лигаза способна специфически распознавать и взаимодействовать с аминокислотами, формирующими поверхность молекулы белка-мишени вокруг точки убиквитилирования — остатка лизина, участвующего в образовании изопептидной связи с молекулой убиквитина. Это предположение основано на том, что в процессе ферментативного удлинения мультиубиквитиновой цепи изопептидная связь формируется при участии лишь одного из семи остатков лизина, имеющихся в составе молекулы убиквитина, а именно Lys48. Исходя из того, что обе стадии формирования убиквитин-белкового конъюгата — убиквитилирование белка-мишени и наращивание мультиубиквитиновой цепи — катализируются теми же компонентами убиквитин-протеин лигазного комплекса, можно допустить, что поверхности обеих белковых молекул содержат идентичные аминокислоты, по которым и происходит специфическое «узнавание» и связывание субстрата ферментом (см. рис. 1).

Основываясь на указанных критериях отбора, помимо собственно убиквитина для биоинформатического анализа нами были взяты молекулы гистона Н2А и a-лактальбумина. Гистон Н2А – исторически первый белок, для которого показана возможность убиквитилирования in vivo и in vitro [23, 24]. Механизм его конъюгации с убиквитином детально охарактеризован, включая идентификацию остатка лизина 119 (Lys119), специфически участвующего в образовании изопептидной связи. Молекула a-лактальбумина, в свою очередь, служит популярным модельным субстратом в экспериментальных исследованиях процесса убиквитилирования [25]. Тот факт, что a-лактальбумин не является нативным эндогенным белком-мишенью, позволяет упростить интерпретацию результатов биоинформатического анализа за счет исключения возможной регуляторной роли факторов более высокого функционального уровня на каталитический процесс.

Проведен анализ структурных предпосылок специфического характера участия остатка Lys48 в образовании изопептидной связи при формировании мультиубиквитиновой цепи. Для исключения фактора возможных стерических ограничений рассчитана степень экспонированности для всех семи остатков лизина, присутствующих в молекуле убиквитина: Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63. Установлено, что доступность для растворителя e-аминогрупп всех указанных аминокислот, за исключением остатка Lys27, колеблется в пределах от 50 до 90%. Эти результаты указывают на то, что специфичность убиквитилирования Lys48 определяется ферментативным механизмом.

На следующем этапе работы нами был проведен анализ поверхности молекулы убиквитина вокруг остатка Lys48 и поверхности молекулы гистона H2A вокруг остатка Lys119. Визуализация трехмерных структур этих белков с помощью программ RasWin и ViewerPro дала возможность проанализировать и сравнить аминокислотный состав, формирующий поверхность молекул этих белков в выбранной области. Сравнение аминокислотного окружения точек убиквитилирования выявило в обеих белках элементы подобия. Оба белка содержат остатки валина и серина, сходным образом позиционированные вокруг соответствующего остатка лизина. Это валин 70 (Val70), серин 57 (Ser57) и валин 114 (Val114), серин 122 (Ser122) для молекул убиквитина и гистона H2A соответственно (рис. 4).

а	б
в

С помощью программы для анализа трехмерных структур ViewerPro, были рассчитаны дистанции между идентичными парами аминокислот в исследуемых белках. Расчет дистанций в обоих случаях дал близкие значения: Lys—Val — 14±1Е, Lys—Ser — 12±1Е и Ser—Val — 22±2Е (см. таблицу).

Молекулярные дистанции (в Е) между идентичными парами аминокислот в исследованных белках

С помощью программы Distance Searcher в молекуле a-лактальбумина проведен поиск аминокислот, отвечающих выявленным критериям. Установлено, что заданные стерические закономерности выполняются для группы лизин-валин-серин, включающей Lys98, Val21 и Ser69 (см. таблицу и рис. 4). Учитывая тот факт, что для a-лактальбумина точка убиквитилирования не идентифицирована, проведенный анализ можно рассматривать как инструмент предсказания акцепторного лизина. Полученные результаты позволяют предположить, что в убиквитилировании a-лактальбумина принимает участие остаток Lys98.

Обсуждение. Метаболическая значимость системы убиквитина определяется ее вовлечением в регуляцию ряда важнейших клеточных процессов: экспрессии генов, апоптоза, передачи внутриклеточного сигнала, пострепликативной репарации ДНК и многих других. Особый интерес для медицины представляют данные о роли убиквитина в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, ишемии мозга и в механизмах канцерогенеза [26—29], вследствие чего система убиквитина в последние годы является предметом интенсивных исследований. Однако несмотря на значительный прогресс в изучении энзимологической стороны проблемы, многие аспекты функционирования данной метаболической системы остаются невыясненными. Одной из актуальных проблем в этой области является установление механизма распознавания ферментом белков-субстратов.

На сегодняшний день предложено несколько возможных механизмов, детерминирующих субстратную специфичность фермента по отношению к различным группам белков-мишеней [15, 30]. Однако ни один из них не является универсальным, что может быть связано со значительной гетерогенностью пула белков-субстратов и, как следствие, многообразием метаболических эффектов убиквитилирования. Накопленные экспериментальные данные дают основание предположить, что механизм специфичности убиквитин-протеин лигазы может быть не уникален для разных групп субстратов.

Накопленный объем функциональных и структурных данных делает целесообразным использование инструментов биоинформатического анализа для исследования механизма, определяющего специфичность отбора субстратов убиквитилирования. Исходя из того, что сравнение первичных структур белков-мишеней на сегодняшний день не принесло положительных результатов [17], в наших исследованиях был сделан акцент на изучении пространственной организации субстратов убиквитилирования и их сравнении с трехмерной структурой поверхности убиквитина. Данный подход основывался на экспериментальных данных об особенностях ферментативного механизма образования убиквитин белковых конъюгатов и удлинения муль­­ти­­убиквитиновой цепи.

Специфическое распознавание ферментом определенного остатка лизина в молекулах убиквитина и гистона Н2А (Lys48 и Lys119 соответственно) дало нам возможность вычленить на поверхности исследуемого белка ограниченную зону, потенциально ответственную за физическое взаимодействие с молекулой фермента. Наличие у обеих молекул в этой зоне остатков серина и валина, сходным образом позиционированных вокруг соответствующего акцепторного лизина, позволило задать стерические условия для анализа трехмерной структуры следующего белка – a-лактальбумина, для которого специфическая точка убиквитилирования не идентифицирована, и провести идентификацию соответствующих аминокислотных остатков на его поверхности.

Таким образом, выбранная стратегия биоинформатического поиска позволила выявить общие структурные особенности в исследованных белках и получить свидетельства в пользу предложенной нами гипотезы о роли идентичных аминокислотных остатков, локализованных на поверхности белковой молекулы, как специфических элементов, детерминирующих «узнавание» убиквитин-протеин лигазой соответствующих белковых субстратов.

Заключение. Проведенный биоинформатический анализ пространственной организации убиквитина и гистона H2A выявил наличие в обеих молекулах идентичных аминокислотных остатков серина и валина, сходным образом позиционированных вокруг остатка лизина, участвующего в образовании изопептидной связи. С использованием оригинальной компьютерной программы «Distance Searcher» установлено, что поверхность молекулы a-лактальбумина содержит тот же набор аминокислот, отвечающий заданным стерическим условиям. Полученные данные свидетельствуют в пользу предложенной нами гипотезы о роли специфических особенностей трехмерной структуры белков-субстратов в их «узнавании» убиквитин-протеин лигазой. Разработанный нами биоинформатический метод структурного анализа может быть использован для предсказания возможной точки убиквитилирования в белках-мишенях и служить основой экспериментального изучения механизма субстратной специфичности убиквитин-протеин лигазы.

Литература

1. Stoesser G., Baker W., van den Broek A., Garcia-Pastor M., Kanz C., Kulikova T. et al. The EMBL Nucleotide Sequence Database: major new developments. Nucl Acids Res 2003; 31: 17—22.
2. The EMBL Nucleotide Sequence Database. http://www.ebi.ac.uk/embl/
3. Bioanalytik. Lottspeich F., Zobras H. (editors). 1998. Heidelberg; Berlin: Spektrum, Akad. Verl., p. 781—784.
4. The SWISS-PROT protein knowledgebase and its supplement TrEMBL. http://www.expasy.org/sprot/
5. Appel R.D., Bairoch A., Hochstrasser D.F. A new generation of information retrieval tools for biologists: the example of the ExPASy WWW server. Trends Biochem Sci 1994; 19: 258—260.
6. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Protein Data Bank (PDB). http://www.rcsb.org/pdb/
7. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H. et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res 2000; 28: 235—242.
8. Дубанов А.В., Иванов А.С., Арчаков А.И. Компьютерный поиск новых белков-мишеней для действия противомикробных средств на основе сравнительного анализа геномов. Вопросы мед химии 2001; 47: 353—367.
9. Ivanov A.S., Dubanov A.V., Skvortsov V.S., Archakov A.I. Computer drug design based on analysis of a target macromolecule structure. I. Search and description of a ligand binding site in a target molecule. Vopr Med Khim 2002; 48: 304—315.
10. Арчаков А.И. Биоинформатика, геномика и протеомика — науки о жизни XXI столетия. Вопросы мед химии 2000; 46: 4—7.
11. Hochstrasser M. Ubiquitin, proteasomes, and the regulation of intracellular protein degradation. Curr Opin Cell Biol 1995; 7: 215—223.
12. Pickart C.M. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem 2001; 70: 503—533.
13. Van Nocker S., Vierstra R.D. Multiubiquitin chains linked through lysine 48 are abundant in vivo and are competent intermediates in the ubiquitin proteolytic pathway. J Biol Chem 1993; 268: 24766—24773.
14. Chau V., Tobias J.W., Bachmair A., Marriott D., Ecker D.J., Gonda D.K. et al. A multiubiquitin chain is confined to specific lysine in a targeted short-lived protein. Science 1989; 243: 1576—1583.
15. Weissman A.M. Themes and variations on ubiquitylation. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 169—178.
16. Jennissen H.P. Ubiquitin and the enigma of intracellular protein degradation. Eur J Biochem 1995; 231: 1—30.
17. Hochstrasser M. New structural clues to substrate specificity in the «ubiquitin system». Mol Cell 2002; 9: 453—454.
18. Vijay-Kumar S., Bugg C.E., Cook W.J. Structure of ubiquitin refined at 1.8 A resolution. J Mol Biol 1987; 194: 531—544.
19. Harp J.M., Hanson B.L., Timm D.E., Bunick G.J. Asymmetries in the nucleosome core particle at 2.5 A resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2000; 56(12): 1513—1534.
20. Chrysina E.D., Brew K., Acharya K.R. Crystal structures of apo- and holo-bovine alpha-lactalbumin at 2.2-A resolution reveal an effect of calcium on inter-lobe interactions. J Biol Chem 2000; 275: 37021—37029.
21. Sayle R.A., Milner-White E.J. RASMOL: biomolecular graphics for all. Trends Biochem Sci 1995; 20: 374.
22. Koradi R., Billeter M., Wuthrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J Mol Graph 1996; 14: 51—32.
23. Goldknopf I.L., French M.F., Musso R., Busch H. Presence of protein A24 in rat liver nucleosomes. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5492—5495.
24. Goldknopf I.L., Busch H. Isopeptide linkage between nonhistone and histone 2A polypeptides of chromosomal conjugate-protein A24. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 864—868.
25. Ferber S., Ciechanover A. Transfer RNA is required for conjugation of ubiquitin to selective substrates of the ubiquitin- and ATP-dependent proteolytic system. J Biol Chem 1986; 261: 3128—3134.
26. Scheffner M., Werness B.A., Huibregtse J.M., Levine A.J., Howley P.M. The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. Cell 1990; 63: 1129—1136.
27. Alves-Rodrigues A., Gregori L., Figueiredo-Pereira M.E. Ubiquitin, cellular inclusions and their role in neurodegeneration. Trends Neurosci 1998; 21: 516—520.
28. Dewar D., Graham D.I., Teasdale G.M., McCulloch J. Cerebral ischemia induces alterations in tau and ubiquitin proteins. Dementia 1994; 5: 168—173.
29. Mayer R.J., Arnold J., Laszlo L., Landon M., Lowe J. Ubiquitin in health and disease. Biochim Biophys Acta 1991; 1089: 141—157.
30. Laney J.D., Hochstrasser M. Substrate targeting in the ubiquitin system. Cell 1999; 97: 427—430.